Sistemin je dobro poznati biljni peptidni hormon koji igra ključnu ulogu u odbrambenom odgovoru biljke protiv biljojeda i patogena. Kao vodeći dobavljač Systemina, razumijevanje kako detektirati Systemin u biljkama je od najveće važnosti, ne samo za naučna istraživanja već i za osiguranje kvaliteta i autentičnosti Systemin proizvoda koje nudimo. U ovom blogu ćemo istražiti različite metode otkrivanja sistemina u biljkama, udubljujući se u naučne principe koji stoje iza svakog pristupa.
1. Imunološke metode detekcije
Imunološke tehnike detekcije se široko koriste za detekciju sistemina u biljkama zbog njihove visoke specifičnosti i osjetljivosti. Ove metode se oslanjaju na upotrebu antitijela koja specifično prepoznaju i vezuju se za Systemin.
Enzimski - vezani imunosorbentni test (ELISA)
ELISA je najčešće korištena imunološka metoda. Uključuje oblaganje mikroploče antitijelom specifičnim za Systemin. Ekstrakti biljaka se zatim dodaju u jažice mikroploče. Ako je sistemin prisutan u ekstraktu, on će se vezati za imobilizirano antitijelo. Nakon toga se dodaje drugo antitijelo konjugirano s enzimom. Ovo sekundarno antitelo se takođe vezuje za Systemin. Nakon ispiranja svih nevezanih tvari, dodaje se supstrat za enzim. Reakcija enzim - supstrat proizvodi signal koji se može detektovati, često promjenu boje, koja se može izmjeriti fotometrijski. Intenzitet signala je proporcionalan količini Systemina u uzorku.
Prednosti ELISA-e uključuju njenu visoku osjetljivost, sposobnost obrade više uzoraka istovremeno i relativnu jednostavnost upotrebe. Međutim, zahtijeva proizvodnju visokokvalitetnih antitijela, a unakrsna reaktivnost s drugim peptidima u biljnom ekstraktu ponekad može biti problem.
Western blotting
Western blotting je još jedna moćna imunološka tehnika. Prvo, biljni proteini se ekstrahuju i razdvajaju gel elektroforezom na osnovu njihove molekularne težine. Odvojeni proteini se zatim prenose na membranu. Antitelo specifično za Systemin inkubira se sa membranom. Nakon ispiranja, dodaje se sekundarno antitijelo konjugirano s reagensom za detekciju (kao što je fluorescentni ili hemiluminiscentni marker). Prisustvo Systemina se vizualizira kao posebna traka na membrani.
Western bloting omogućava određivanje molekularne težine Systemina i može pružiti informacije o njegovim mogućim modifikacijama. Međutim, zahtijeva više vremena i tehnički zahtjevnije u odnosu na ELISA.
2. Masena spektrometrija – detekcija na bazi
Masena spektrometrija (MS) je vrlo precizna i svestrana metoda za detekciju sistemina u biljkama. Može identificirati i kvantificirati peptide na osnovu njihovog omjera mase i naboja (m/z).
Tekuća hromatografija - masena spektrometrija (LC - MS)
U LC - MS, biljni ekstrakti se prvo odvajaju tečnom hromatografijom. Odvojene komponente se zatim uvode u maseni spektrometar. Maseni spektrometar ionizira molekule i mjeri njihove m/z vrijednosti. Poređenjem dobijenih m/z vrijednosti sa teorijskim m/z Systemina, može se potvrditi prisustvo Systemina.
LC - MS nudi visoku rezoluciju i mogućnost detekcije Systemina čak iu složenim biljnim matricama. Takođe može pružiti informacije o strukturi i mogućim posttranslacionim modifikacijama Systemina. Međutim, to zahtijeva skupu opremu i visoko obučeno osoblje.
Tandem masena spektrometrija (MS/MS)
MS/MS je proširenje masene spektrometrije. Nakon početne analize mase u prvom masenom spektrometru, odabrani ioni se fragmentiraju, a fragmenti se analiziraju u drugom masenom spektrometru. Ovo omogućava određivanje aminokiselinske sekvence Systemina, što je neophodno za potvrdu njegovog identiteta.
MS/MS je posebno koristan kada se radi o uzorcima gdje mogu postojati izobarični ili izomerni peptidi koji bi mogli ometati identifikaciju. Pruža detaljne strukturne informacije o Systeminu, ali je takođe složeniji i dugotrajniji od jednostepene masene spektrometrije.
3. Molekularna biologija – detekcija zasnovana na molekularnoj biologiji
Tehnike molekularne biologije se također mogu koristiti za otkrivanje Systemina na nivou ekspresije gena.
Reverzna transkripcija - lančana reakcija polimeraze (RT - PCR)
RT - PCR se koristi za otkrivanje mRNA koja kodira Systemin. Prvo, ukupna RNK se ekstrahuje iz biljnih tkiva. mRNA se zatim reverzno prepisuje u komplementarnu DNK (cDNK) pomoću reverzne transkriptaze. Specifični prajmeri za gen Systemin se koriste za amplifikaciju cDNK PCR-om. Amplificirani fragmenti DNK mogu se vizualizirati gel elektroforezom.
RT - PCR omogućava otkrivanje ekspresije Systemin gena, što može ukazati na fiziološko stanje biljke u smislu njenog odbrambenog odgovora. Međutim, on samo pruža informacije o potencijalnoj proizvodnji Systemina na nivou transkripcije i ne mjeri direktno prisustvo samog peptida.
Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT - PCR)
qRT - PCR je naprednija verzija RT - PCR. Omogućava kvantifikaciju količine Systemin mRNA u uzorku. Tokom PCR reakcije, fluorescentna boja ili fluorescentno označena sonda se koristi za praćenje amplifikacije u realnom vremenu. Ciklus u kojem signal fluorescencije prelazi prag (vrijednost Ct) obrnuto je proporcionalan količini ciljne mRNA.
qRT - PCR pruža precizniju kvantifikaciju ekspresije Systemin gena u poređenju sa tradicionalnim RT - PCR. Koristan je za proučavanje regulacije proizvodnje sistemina kao odgovora na različite stimuluse.
4. Biotest – detekcija zasnovana na
Biološki testovi se oslanjaju na biološku aktivnost Systemina da bi otkrili njegovo prisustvo. Na primjer, poznato je da Systemin indukuje sintezu inhibitora proteaze u biljkama. Biotest se može postaviti tretiranjem biljnih tkiva uzorkom za koji se sumnja da sadrži sistemin i zatim mjerenjem indukcije inhibitora proteaze.
Prednost bioloških testova je u tome što direktno mjere biološku aktivnost Systemina. Međutim, oni su manje specifični u odnosu na druge metode i na njih mogu utjecati drugi faktori u biljnom ekstraktu koji također mogu utjecati na sintezu inhibitora proteaze.
Zaključak
Kao Systemin dobavljač, razumijemo važnost tačne i pouzdane Systemin otkrivanja. Svaka od gore opisanih metoda ima svoje prednosti i ograničenja. Imunološke metode su vrlo specifične i osjetljive, masena spektrometrija pruža detaljne strukturne informacije, tehnike molekularne biologije daju uvid u ekspresiju gena, a biotestovi mjere biološku aktivnost. U praksi se može koristiti kombinacija ovih metoda kako bi se osigurala tačna detekcija i kvantifikacija Systemina u biljkama.
Ako ste zainteresirani za kupovinu visokokvalitetnog Systemina za svoje istraživanje ili druge primjene, pozivamo vas da nas kontaktirate za daljnje razgovore. Posvećeni smo pružanju najboljih proizvoda i usluga. Možda će vas zanimati i neki od naših drugih peptidnih proizvoda, kao nprGlikoprotein IIb fragment (296 - 306),PHM - 27 (ljudi), isekretin (pacov).
Reference
- Ryan, CA (2000). Sistemski signalni put: diferencijalna aktivacija odbrambenih gena biljaka. Biochimie, 82(10 - 11), 847 - 853.
- Schilmiller, AL, & Howe, GA (2005). Sistemin: polipeptidni signal za odbrambene reakcije biljaka. Current Biology, 15(18), R744 - R747.
- van der Hoorn, RA, & Jones, JD (2004). Proteaze u odbrani od patogena. Current Opinion in Plant Biology, 7(4), 400 - 406.