Hej tamo! Ja sam dobavljač TET - 213 ćelija, a danas ću vas prošetati kako izvesti imunofluorescentne bojenje u ovim ćelijama. Immunofluorescentno bojenje je super korisna tehnika u svijetu biologije ćelije. Pomaže nam da vizualiziramo određene proteine unutar ćelija, što nam daje bolje razumijevanje njihovih funkcija i lokacija.
Priprema TET - 213 ćelije
Prvo prvo, trebamo dobiti naš Tet - 213 ćelije. Počnite rastići ih u odgovarajućem kulturnom medijumu. Ove ćelije obično dobro rade u medijumu poput RPMI 1640 dopunjene sa 10% nosivim goveđem serumom (FBS) i 1% penicilin - streptomicin. Inkubirajte ćelije na 37 ° C u atmosferi od 5%.
Nakon što ćelije dostignu oko 70 - 80% ušća, vrijeme je za pokretanje postupka bojenja. Trebat ćete sjemene ćelije na poklopce u ploči od 24 - bušotine. To olakšava rukovanje ćelijama tokom koraka za bojenje. Upotrijebite pipetu da biste pažljivo prebacili stanični ovjes na korice. Obavezno distribuirajte ćelije ravnomjerno.
Popravljanje ćelija
Nakon što su stanice pričvršćene na pokrivače (obično nakon 24 sata), vrijeme je da ih popravite. Fiksacija je ključna jer čuva staničnu strukturu i održava proteine na mjestu. Možete koristiti fiksativ poput 4% paraformaldehida (PFA) u fosfatu - puferiranu slanicu (PBS). Dodajte dovoljno PFA da pokrije ćelije na koricama i ostavite da sjedi na sobnoj temperaturi oko 15 - 20 minuta.
Jednom kada se fiksiranje učini, tri puta operite ćelije sa PBS-om. Svako pranje treba trajati oko 5 minuta. Ovo pomaže u uklanjanju viška fiksativa iz ćelija.
Permeabilizacija
Sljedeće je permeabilizacija. Ovaj korak omogućava antitijevima da uđu u ćelije i vežu se na ciljne proteine. Koristite sredstvo za permeabilizaciju poput 0,1% tritona X - 100 u PBS-u. Dodajte puštanje lijepljenja na stanice i pustite da se inkubira na sobnoj temperaturi oko 10 minuta.
Nakon toga operite ćelije tri puta sa PBS-om ponovo, baš kao i u prethodnom koraku. To osigurava da se sredstvo za permeabilizaciju potpuno ukloni.
Blokiranje
Blokiranje je važan korak za sprečavanje ne-specifičnog obvezanja antitijela. Možete koristiti blokiranje rješenja kao što je 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) u PBS-u. Dodajte rješenje za blokiranje stanicama i pustite da inkubiraju na sobnoj temperaturi oko 1 sat.
Primarna inkubacija antitijela
Sada je vrijeme za dodavanje primarnog antitijela. Primarna antitijela specifična je za proteinu koji želite otkriti u TET - 213 ćelija. Razrijedite primarno antitijelo u rješenju blokiranja prema uputama proizvođača.
Pažljivo uklonite rješenje za blokiranje iz ćelija i dodajte razblaženo primarno antitijelo. Obavezno pokriti ćelije u potpunosti s otopinom antitela. Inkubirajte ćelije primarnom antitijelu preko noći na 4 ° C. Ovaj dugo vrijeme inkubacije omogućava da se antitijelo učinkovito veže na ciljni protein.
Sledećeg dana operite ćelije tri puta sa PBS-om, sa svakim pranjem traje oko 5 minuta. To se riješi bilo kakvog nevezanog primarnog antitijela.
Sekundarna inkubacija antitijela
Nakon primarnog inkubacije antitijela, vrijeme je za sekundarno antitijelo. Sekundarno antitijelo je označeno fluorescentnom bojom, što nam omogućava da vizualiziramo ciljani protein pod fluorescentnim mikroskopom.
Razblažite sekundarno antitijelo u rješenju blokiranja prema uputama proizvođača. Izvadite PBS iz ćelija i dodajte razblaženo sekundarno antitijelo. Inkubirajte ćelije na sobnoj temperaturi za oko 1 - 2 sata u mraku. Tamno okruženje važno je za sprečavanje fluorescentne boje izblijedjelo.
Jednom kada se inkubacija završi, tri puta operite ćelije sa PBS-om, baš kao i prije.
Worterstaining
Worterstaining se koristi za vizualizaciju ćelijskog jezgra. Možete koristiti boju poput Dapi (4 ', 6 - Diamidino - 2 - Phenilyindole). Razblažite Dapi u PBS i dodajte ga u ćelije. Neka se inkubira na sobnoj temperaturi oko 5 minuta.
Nakon toga operite ćelije još jednom sa PBS-om da biste uklonili višak dapi.
Ugradnja
Konačno, vrijeme je za postavljanje korica na mikroskopske dijapozitive. Upotrijebite montažni medij, što pomaže u održavanju stanica na mjestu i čuva i fluorescencija. Pažljivo stavite kap montažnog medija na klizanje mikroskopa, a zatim invertirajte poklopac na kap. Provjerite da nema mjehurića zraka zarobljenih između prekrivača i klizača.
Snimak
Sada ste spremni za slika ćelije pod fluorescentnim mikroskopom. Koristite odgovarajuće filtre da vizualizujete fluorescentne signale iz sekundarnog antitijela i Dapija. Možete preuzeti više slika na različitim poljima polja da biste dobili dobar prikaz ćelija.
Korištenje povezanih peptida u procesu
Tokom procesa kulture i bojenje ćelije, možda ćete naći i neke peptide korisne. Na primjer,(Gly14) -hmanin (ljudski)pokazalo se da imaju neke korisne efekte na održivost i funkciju ćelije. Možete ga dodati u kulturni medij da biste vidjeli da li utječe na izraz proteina koji studirate u TET - 213 ćelija.
Fibronektin CS1 peptidmože se koristiti za oblaganje korica prije sjemena ćelija. To može poboljšati pričvršćivanje i širenje ćelija, čineći proces bojenja efikasnijim.
Endothelin - 1 (11 - 21)Može igrati i ulogu u signalnim putevima unutar TET - 213 ćelija. Možete ga dodati u medij za kulturu, a zatim proučite kako utječe na ciljni izraz proteina kroz imunofluorescentne bojenje.
Zaključak
Izvođenje imunofluorescentne bojenje na Tet - 213 ćelije može biti malo škakljivog procesa, ali ako pažljivo slijedite ove korake, trebali biste biti u mogućnosti dobiti nekoliko sjajnih rezultata. To je moćna tehnika koja vam može dati vrijedne uvide u biologiju ovih ćelija.
Ako ste zainteresirani za kupovinu TET - 213 ćelija ili bilo koji od povezanih peptida spomenutih u ovom blogu, slobodno se posegne za nama za više informacija i pokrenuti raspravu o nabavci. Ovdje smo da vam pomognemo u svim potrebama svoje mobilne biologije.
Reference
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. i Walter, P. (2002). Molekularna biologija ćelije. Garland Science.
- Polar, TD, & Earcheshaw, WC (2004). Biologija ćelija. Saunders.