U carstvu peptidnog istraživanja i razvoja čistoća kataloške peptide je od najveće važnosti. Kao posvećeni dobavljač peptida kataloga, razumijemo značaj pružanja visokog kvaliteta proizvoda našim kupcima. Ponekad, uprkos našim najboljim naporima u početnim procesima sinteze i pročišćavanja, može postojati potreba za daljnjim pročišćavanjem pipta kataloga. U ovom blogu ćemo istražiti različite metode i razmatranja za daljnje pročišćavajuće kataloške peptide po potrebi.
Zašto daljnje pročišćavanje?
Postoji nekoliko razloga zbog kojih je možda potrebno daljnje pročišćavanje kataloških peptida. Prvo, u vrlo osjetljivim istraživačkim primjenama kao što su testovi zasnovanih na ćelijama, u vivojskoj studijama ili strukturnim istraživanjima biologije, čak i u tragovima nečistoća mogu imati značajan utjecaj na eksperimentalne rezultate. Nečistoće bi se mogle potencijalno miješati u biološku aktivnost peptida, što je dovelo do lažnih pozitivnih ili negativa.
Drugo, regulatorni zahtjevi u nekim industrijama, poput lijekova, zahtijevaju vrlo visok nivo čistoće za peptide koji se koriste u razvoju lijekova. Ako se peptid smatra potencijalnim terapijskim agentom, bilo kakve nečistoće mogu predstavljati rizike za sigurnost pacijenata, a samim tim i dodatni koraci pročišćavanja su od suštinskog značaja.
Hromatografske metode
Reversed - visoki fazi - tečna hromatografija (RP - HPLC)
RP - HPLC je jedna od najčešće korištenih metoda za pročišćavanje peptida. Razdvaja peptide na osnovu njihove hidrofobičnosti. Stacionarna faza u RP - HPLC je hidrofobni materijal, obično silika - na bazi stupca sa priloženim alkil lancima (npr. C18 ili C8). Peptidi s različitim hidrofobnostima različito će komunicirati s stacionarnom fazom, što rezultira različitim vremenima zadržavanja.
Da biste dodatni pročistili kataloške peptide pomoću RP - HPLC, prvo moramo odabrati odgovarajuću mobilnu fazu. Zajednička mobilna faza sastoji se od mješavine vode i organskog otapala kao što su acetonitril ili metanol, uz dodatak male količine kiseline (npr. Trifluoroocetic kiseline, TFA) za poboljšanje vrha. Podešavanjem gradijenta organskog otapala, možemo optimizirati odvajanje ciljanog peptida od nečistoća.
Na primjer, ako imamo katalog peptid poputLL-37, antimikrobni peptid, koji je antimikrobni peptid s potencijalnim terapijskim aplikacijama, RP - HPLC može se koristiti za uklanjanje bilo koje preostale sinteze - proizvodi ili degradirani fragmenti. Pročišćeni LL - 37 se tada može koristiti u preciznijim testovima antimikrobne aktivnosti.
Ion - Razmjena hromatografije
Ion - razmjena hromatografije razdvaja peptide na osnovu njihovog naboja. Postoje dvije glavne vrste: kation - razmjena hromatografije (CEX) i anion - razmjena hromatografije (AEX). U CEX-u stacionarna faza ima negativno nabijenu grupu, a peptidi s neto pozitivnim nabojem. U AEX-u je stacionarna faza pozitivno naplaćena, a negativno se naplaćuju peptidi.
Izbor između CEX-a i AEX-a ovisi o izoelektričnoj tački (PI) peptida. Ako je PI peptida ispod pH mobilne faze, peptid će imati neto negativan naboj i može se koristiti AEX. Suprotno tome, ako je PI iznad pH mobilne faze, CEX je prikladniji.
Na primjer,UreistachykinIn II, peptid sa specifičnim profilom punjenja, može se dodatno pročistiti pomoću ION-a - razmjene hromatografije. Pažljivo odabirom pH mobilne faze i jonske čvrstoće, možemo postići dobro odvajanje ciljanog peptida iz drugih napunjenih nečistoća.
Elektroforetičke metode
Natrijum dodecil sulfate - poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS - Stranica)
Iako se SDS - stranica uglavnom koristi za analizu proteina, može se primijeniti i na pročišćavanje peptida u određenoj mjeri. U SDS-u - Stranica, peptidi su denaturirani SDS-om i odvojeni na osnovu njihove molekularne težine. Peptidi migriraju kroz poliakrilamidni gel pod utjecajem električnog polja.
Nakon elektroforeze, gel se može obojiti kako bi vizualizirao peptide. Bend koji odgovara ciljanom peptidu može se potaknuti iz gela, a peptid se može izvući iz gel matrice. Međutim, ova metoda ima određena ograničenja. Proces elumata može biti složen, a možda će doći do nekih gubitka peptida tokom pročišćavanja. Takođe, SDS može biti teško u potpunosti ukloniti iz pročišćenog peptida.
Kapilarna elektroforeza (CE)
Kapilarna elektroforeza je moćna tehnika odvajanja peptida. Nudi visoku efikasnost odvajanja, kratko vrijeme analize i malu potrošnju uzoraka. CE odvaja peptide na osnovu njihovog naboja - omjer masovnosti. Postoje različiti načini CE-a, poput elektroforeze kapilarne zone (CZE), elektroforeza kapilarne gel (CGE) i micelarne elektrokinetičke kromatografije (MEKC).
CZE je najčešće korišten režim za analizu peptida i pročišćavanje. U CZE, peptidi su odvojeni u međuspremniku - napunjeni kapilari pod električnim poljem. Odvajanje se temelji na razlikama u elektroforetskoj mobilnosti peptida. CE se može povezati s različitim metodama otkrivanja, poput UV apsorpcije, fluorescencije i masovne spektrometrije, za poboljšanje tačnosti peptidne identifikacije i pročišćavanja.
Ostala razmatranja
Rastvorljivost
Rastvorljivost peptida važan je faktor u procesu pročišćavanja. Ako peptid ima lošu rastvorljivost u otapalima za pročišćavanje, može dovesti do padavina tokom pročišćavanja, što će utjecati na oporavak i čistoću peptida. Za poboljšanje peptidnog rastvorljivosti, možemo prilagoditi pH otapala, Dodaj CO - otapala ili koristiti određene agense za solubiliziranje.
Analiza čistoće
Nakon daljnjeg pročišćavanja, ključno je analizirati čistoću peptida. Uobičajene metode za analizu čistoće uključuju visoku tekuću kromatografiju (HPLC), masovne spektrometrije (MS) i nuklearna magnetska rezonanca (NMR). HPLC može pružiti informacije o kromatografskoj čistoći peptida, dok MS može potvrditi molekularnu težinu peptida i otkriti nečistoće s različitim masama. NMR se može koristiti za određivanje strukture i čistoće peptida na atomskom nivou.
Zaključak
Kao kataloški dobavljač peptida posvećeni smo pružanju visokog kvaliteta peptida našim kupcima. Kada je potrebno daljnje pročišćavanje kataloških peptida, imamo različite metode na raspolaganju, uključujući hromatografske metode, elektroforetske metode i druga razmatranja kao što su analiza topljivosti i čistoće. Pažljivo odabirom odgovarajuće metode pročišćavanja i optimiziranje uvjeta pročišćavanja, možemo osigurati da peptidi ispunjavaju visoke potrebe čistoće naših kupaca.
Ako imate bilo kakvih potreba za kataloškim peptidima ili zahtijevati daljnje usluge pročišćavanja, slobodno nas kontaktirajte za nabavku i diskusiju. Radujemo se što ćemo sarađivati s vama kako bismo ispunili vaše potrebe za istraživačkim i razvojem peptida.
Reference
- Snyder, LR, Kirkland, JJ, & Dolan, JW (2010). Uvod u modernu tečnu hromatografiju. Wiley.
- Jorgenson, JW i Lukacs, KD (1981). Kapilarna zona elektroforeza. Analitička hemija, 53 (8), 1298 - 1302.
- Laemmli, Velika Britanija (1970). Cjepavanje strukturnih proteina tokom montaže šefa bakteriofaga T4. Priroda, 227 (5259), 680 - 685.