Transekcija je ključna tehnika u molekularnoj biologiji koja omogućava uvođenje stranih nukleinskih kiselina u ćelije, omogućavajući istraživačima da studiraju funkciju gena, izraz proteina i stambene puteve signalizacije. TET-213 ćelije, Cjelijsku liniju ljudskog neuroblastoma, obično se koriste u istraživanju neuroznanosti zbog njihovih neuronskih svojstava. U ovom blogu podijelit ću neke uvide o tome kako efikasno preneti TET-213 ćelije, crtanjem na mojim iskustvom kao dobavljača ćelije Tet-213.
Razumijevanje TET-213 ćelija
Prije nego što se unesete u proces transfekcije, važno je razumjeti karakteristike TET-213 ćelija. Ove ćelije su izvedene iz ljudskog neuroblastoma i izložbenih karakteristika neurona, kao što su sposobnost proširenja neurita i izražavanja neoričnih markera. Oni su pridržane ćelije koje dobro rastu u standardnim uvjetima kulture ćelija, obično u srednjem dopunjenom serumu u fetulom (FBS) i antibioticima.
Odabir desne metode transfekcije
Dostupno je nekoliko metoda za pretvorene ćelije, svaka sa vlastitim prednostima i ograničenjima. Izbor metode transfekcije ovisi o različitim faktorima, uključujući vrstu nukleinske kiseline koja će se presticati, tipa ćelije i željenu efikasnost transfekcije. Evo nekoliko uobičajenih metoda presjeka pogodnih za TET-213 ćelije:
Transekcija na bazi lipida
Transsekcija na bazi lipida jedna je od najčešće korištenih metoda za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije. Uključuje upotrebu reagensa zasnovanih na lipidima koji oblikuju komplekse sa nukleinom kiselinom, koji su potom preuzeli ćelije kroz endocitozu. Transsekcija na bazi lipida relativno je jednostavna za obavljanje i može postići visoku efikasnost presjeka u mnogim vrstama ćelija, uključujući TET-213 ćelije.
Elektroporacija
Elektroporacija je fizička metoda koja koristi električno polje za stvaranje privremenih pora u ćelijskoj membrani, omogućavajući nukleinu kiselinu da uđe u ćelije. Ova metoda je posebno korisna za pretvorene ćelije koje su teško transformirati koristeći druge metode, poput primarnih ćelija. Međutim, elektroporacija može biti štetnija za ćelije i može zahtijevati optimizaciju parametara elektroponoškim za postizanje velike efikasnosti presjeka.
Virusna transdukcija
Virusna transdukcija uključuje upotrebu virusnih vektora za isporuku nukleinske kiseline u ćelije. Virusni vektori izvedeni su iz virusa koji su dizajnirani za nošenje željene nukleinske kiseline i mogu efikasno zaraziti ćelije. Virusna transkukcija može postići visoku efikasnost presjeka i može se koristiti za pretvorbu širokog spektra tipova ćelija, uključujući TET-213 ćelije. Međutim, virusna transkukcija zahtijeva specijalizirana oprema i stručnost, a postoje potencijalne sigurnosne probleme povezane sa korištenjem virusnih vektora.
Priprema ćelija za transfekciju
Pravilna priprema ćelije od suštinskog je značaja za uspješnu transfekciju. Evo nekoliko koraka koje trebate slijediti prilikom pripreme TET-213 ćelija za transfekciju:
Kultura ćelije
Održavajte TET-213 ćelije u odgovarajućem medije ćelijskog kulture dopunjene FBS i antibioticima. Redovno prolazite ćelije kako biste održali svoju fazu rasta eksponencijalne. Važno je koristiti zdrave, aktivno rastuće ćelije za transfekciju, jer ćelije u lošem fiziološkoj državi mogu imati nižu efikasnost transfekcije.
Sjedanje ćelija
Sjeme TET-213 ćelije u kulturnom posudu ili višenamjenskim pločicama po odgovarajućoj gustoći. Gustina sjeme ovisi o metodi transfekcije i vrsti eksperimenta. Za transfekciju zasnovana na lipidima, obično se preporučuje gustoća sjetve od 50-80% ušća.
Ćelijska inkubacija
Inkubirajte sjemećene ćelije u vlažan inkubator na 37 ° C sa 5% CO2 najmanje 24 sata prije transfekcije kako biste omogućili da ćelije pričvrstiti i oporaviti od procesa sjetve.
Izvođenje transfekcije
Nakon što se stanice pripremljene, vrijeme je za obavljanje transfekcije. Evo općeg protokola za prenošenje lipida na TET-213 ćelija:
Pripremite reagens za transfekciju
Slijedite upute proizvođača da biste pripremili reagens za prepisnike na bazi lipida. To obično uključuje razrjeđivanje reagensa u prikladnom mediju za transfekciju.
Pripremite nukleinsku kiselinu
Pripremite nukleičnu kiselinu koja se preniči, poput plazmidne DNK ili sirne. Razblažite nukleinu kiselinu u odgovarajućem mediju za transfekciju.
Formiraju kompleks transfekcije
Pomiješajte razblaženi reagens prepisni reagens i razrijeđenu nukleičnu kiselinu u cijevi i inkubirajte na sobnoj temperaturi 15-30 minuta kako biste omogućili formiranje kompleksa presjeka.
Dodajte kompleks transfekcije u ćelije
Izvadite kulturu medija iz ćelija i zamijenite ga svježim medijima za presjek. Dodajte kompleks transfekcije u pad ćelije i lagano se vrtjeti ploče da ravnomjerno distribuira kompleks.
Inkubirati ćelije
Inkubirajte prestičene ćelije u vlažan inkubator na 37 ° C sa 5% CO2 za odgovarajući vreme, ovisno o vrsti nukleinske kiseline i eksperimenta. Za transfekciju PLASMID DNK, vrijeme inkubacije od 24-48 sati obično je dovoljan da omogući izraz gena.
Procjena efikasnosti transfekcije
Nakon transfekcije važno je procijeniti efikasnost transfekcije kako bi se utvrdilo je li transfekcija bila uspješna. Na raspolaganju je nekoliko metoda za procjenu efikasnosti transfekcije, uključujući:
Fluorescentna mikroskopija
Ako prestičena nukleinska kiselina kodira fluorescentni protein, poput GFP-a, fluorescentna mikroskopija može se koristiti za vizualizaciju transkrivenih ćelija. Procenat fluorescentnih ćelija može se koristiti kao procjena efikasnosti transfekcije.
Cytometrija protoka
Cytometrija protoka može se koristiti za kvantifikaciju postotka prestikičnih ćelija na osnovu izražavanja fluorescentnog markera ili stanične površinske antigen. Ova metoda pruža precizniju i kvantitativniju mjeru efikasnosti prestike u odnosu na fluorescentnu mikroskopiju.
Zapadni bluting ili QPCR
Ako prestičena nukleinska kiselina kodira protein kamate, zapadni bluting ili QPCR može se koristiti za otkrivanje izraza proteina na nivou proteina ili MRNA, respektivno. Ova metoda može pružiti informacije o nivou izražavanja gena i funkcionalnosti prestičenog proteina.
Rešavanje problema Uobičajene probleme sa presjekom
Transporcija ponekad može biti izazovna, a može se pojaviti nekoliko uobičajenih problema. Evo nekih savjeta za rješavanje problema za zajedničke probleme sa presjekom:
Niska efikasnost transfekcije
- Provjerite kvalitetu i količinu nukleinske kiseline. Provjerite je li nukleinska kiselina čista i visokog kvaliteta.
- Optimizirajte uvjeti za transfekciju, poput koncentracije reagensa prepiranja, omjer nukleinske kiseline i reagensa i vrijeme inkubacije.
- Provjerite zdravlje i održivost ćelija. Provjerite da li su ćelije zdrave i aktivno rastu prije prepiska.
- Isprobajte drugu metodu ili reagense za transfekciju.
Toksičnost za ćeliju
- Smanjite koncentraciju reagensa transfekcije ili nukleinsku kiselinu.
- Optimizirajte uvjete za transfekciju da biste smanjili oštećenje ćelija.
- Upotrijebite drugu metodu ili reagense za transfekciju koja je manje toksična za stanice.
Promjenjiva efikasnost presjeka
- Provjerite jesu li ćelije zasjenjene ravnomjerno i u odgovarajućoj gustini.
- Temeljito pomiješajte kompleks transfekcije prije nego što je dodate u ćelije.
- Inkubirajte ćelije pod konzistentnim uvjetima za minimiziranje varijabilnosti.
Zaključak
Transponiranje TET-213 ćelije mogu biti izazovni, ali nagradni proces. Odabirom odgovarajuće metode transfekcije, pravilno pripremajući ćelije i slijedeći odgovarajući protokol, možete postići visoku efikasnost presjeka i pribaviti pouzdane rezultate. Ako imate bilo kakvih pitanja ili vam je potrebna dodatna pomoć sa TET-213 prijenosom ćelije, molimo ne ustručavajte se kontaktirati nas. Vodeći smo dobavljač TET-213 ćelija i možemo vam pružiti kvalitetne ćelije, reagense za transfekcije i tehničku podršku.
Pored TET-213 ćelija, nudimo i širok spektar peptida, uključujućiGalanan (ljudski),Ciklo (rgdfc), iDynrorphin a (1-13), amid, svinc. Ti se peptidi mogu koristiti u raznim istraživačkim aplikacijama, poput neuroznanosti, istraživanja raka i otkrića droga.
Ako ste zainteresirani za kupovinu TET-213 ćelija ili bilo kojeg od naših peptida, kontaktirajte nas kako bismo razgovarali o vašim specifičnim potrebama. Radujemo se što ćemo sarađivati s vama i pomagati vam da postignete svoje istraživačke ciljeve.
Reference
- Sambrook, J. i Russell, DW (2001). Molekularna klonizacija: laboratorijski priručnik. Hladna proljetna luka laboratorija.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, Re, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (ur.). (2002). Trenutni protokoli u molekularnim biologiji. John Wiley & Sons.
- Chen, C. i Okayama, H. (1987). Visoka efikasnost transformacija ćelija sisara od plazmida DNK. Molekularna i ćelijska biologija, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., & Hofschneider, pH (1982). Genski prenos u miša Lyoma ćelije elektroporacijom u visokim električnim poljima. Embo časopis, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... & Verma, im (1996). U Vivo genu dostavu i stabilnu transdukciju noddividing ćelija od strane lentiviralnog vektora. Nauka, 272 (5259), 263-267.